Пробијање оралне баријере (3)

Откриће, оптимизација и накнадна модификација ПН-235 (ицотрокинра, ЈН-2113)

Предности орално примењених цикличних пептида су детаљно описане у претходним чланцима, при чему је значајна пажња посвећена ПН-235 као једном од ретких цикличних пептидних лекова који су тренутно доступни за оралну примену. Дана 21. јула 2025., Протагонист и Јанссен су објавили да су ФДА-и предали апликацију за нови лек (НДА) за Ицотрокинра, за лечење умерене до тешке псоријазе плака код одраслих и деце од 12 и више година. Ако буде одобрен, очекује се да ће Ицотрокинра постати први орални лек на свету који циља на ИЛ-23Р за лечење псоријазе. Овај чланак се фокусира на процес откривања и стратегије систематске оптимизације овог молекула, користећи датуме објављивања патента као временску линију, а такође сумира потенцијалне правце за даљу оптимизацију.

Већ 2007. године, Валорисатион Хсј, Социете Ен Цоммандите поднела је патентну пријаву за ИЛ-23Р пептидне антагонисте (ВО2009007849). Ово је један од најранијих патената који укључује ИЛ-23Р пептидне антагонисте у јавно доступним информацијама. Овај патент описује серију пептида који циљају ИЛ-23Р, укључујући агонист АПГ-2301 и антагонисте АПГ-2303, АПГ-2305, АПГ-2307 и АПГ-2309 (секвенце приказане на слици испод). Тим је користио аминокиселинску секвенцу ИЛ-23Р као основу, у комбинацији са техникама компјутерског моделирања, да генерише линеарне пептиде који одговарају његовом зглобном региону (имитирају ИЛ-23 и делују као антагонисти ИЛ-23Р). Међу њима, АПГ-2305 и АПГ-2309 су ефикасно инхибирали фосфорилацију СТАТ3 у спленоцитима миша ин витро, са ИЦ50 вредностима од 1 нМ и 2 нМ, респективно. Штавише, у моделу ИБД код пацова, третман са АПГ-2309 значајно је ублажио едем и црвенило изазване упалом и значајно смањио инфилтрацију леукоцита слузокоже и васкуларну конгестију, показујући добар антиинфламаторни и терапеутски потенцијал.

Године 2013., Медицал Диагностиц Лабораториес (МДЛ) објавиле су патент (УС20130029907) који описује откриће ИЛ-23Р-везујућих пептида коришћењем технологије приказа фага, успешно идентификујући неколико пептидних секвенци које се специфично везују за ИЛ{{19} Ово истраживање је конструисало библиотеку приказа М13 фага која садржи насумичне секвенце пептида од 12-мера и извршило је више кругова скрининга користећи растворљиви рекомбинантни ИЛ-23Р пуне дужине и његове варијанте спајања као мете. На крају, идентификовано је 27 пептида са активношћу везивања. Значајно је да су ове пептидне секвенце показале ниску сличност са кристалном структуром ИЛ-23 коју су пријавили Беиер ет ал. (ПДБ ИД: 3Д85). Кроз поравнавање секвенце, истраживачи су открили да 66,7% пептида садржи очувану секвенцу препознавања: -ВКС1Кс2Кс3В-, за коју се претпостављало да је кључни функционални мотив за везивање за ИЛ-23Р и блокирање његове низводне трансдукције сигнала (репрезентативна секвенца је приказана на слици испод). Након тога, истраживачи су проценили инхибиторну активност пептида на везивање ИЛ-23 за ИЛ-23Р коришћењем компетитивних ЕЛИСА експеримената, идентификујући пептид 23 (12-мерни пептид) као најактивнији пептид, који је значајно инхибирао везивање ИЛ-23} за ИЛ-23Р (ИЛ-23Р).

На основу овога, тим је оптимизовао структуру пептида 23, укључујући проширење или скраћивање Ц/Н завршетака, замену унутрашњих амино киселина киселим/неутралним/базним амино киселинама и модификације циклизације. Конкурентни резултати ЕЛИСА показали су да проширење аминокиселина на оба краја пептида 23 има мали утицај на његову инхибиторну активност, али скраћивање доводи до смањења инхибиторне активности. Модификовање својстава наелектрисања „Кс“ остатака у мотиву језгра -ВКС1Кс2Кс3В- (нпр. замена негативно наелектрисаних остатака другим негативно наелектрисаним, поларним ненаелектрисаним или позитивно наелектрисаним остацима) није значајно утицало на његову инхибиторну активност, што указује да карактеристике наелектрисања у овом региону нису кључне активности остатка. Замена једног од остатака триптофана (В) у структури језгра са фенилаланином (Ф) или тирозином (И) задржала је његову инхибиторну способност, док је замена са аланином (А) смањила активност, што је у складу са карактеристикама секвенце добијеним из претходног скрининга фаг дисплеја.

Штавише, скраћивање пептида 23.15 уз задржавање структуре језгра -ВКДИВ-, иако је мотив језгра очуван, значајно је ослабио његову инхибиторну активност. Поред тога, увођење цистеина (Цис) на оба краја да би се формирао циклични пептид резултирало је активношћу која је упоредива са линеарним пептидом; међутим, смањење величине цикличног пептида на 7 или 9 пептида уз одржавање структуре језгра значајно је ослабило његову способност да инхибира ИЛ-23Р.

У два наредна патента објављена од стране МДЛ-а (УС20130172272 и УС20160039878), истраживачи су користили структуру језгра -ВКС1Кс2Кс3В- као скелу и конструисали и прегледали циљану библиотеку пептида користећи технологију приказа рибозома (секвенца библиотеке пептида:ВКС КСКСКСВКСКСИ). После осам рунди скрининга, пептиди су даље подељени на основу структуре -ВКС1Кс2ИВ-: група А је садржала -ВВДИВ-, група Б је садржала -ВКДИВ-, а група Ц је садржала пептиде са другим језгром. ЕЛИСА тестови активности су показали да је пептид бр.{17}}/7 у групи А имао супериорну активност у поређењу са пептидом бр.{19}} откривеним у претходном патенту. У конкурентним ЕЛИСА тестовима, пептид бр.{21}} је имао ИЦ50 од 58,0 нМ, а пептид бр{24}} имао је ИЦ50 од 34,6 нМ.

Након тога, користећи Пептид НО.2 и Пептид НО.7 као полазне тачке, дизајнирана су и синтетизована три циклична пептида: 2ХТ-АА, 7-ЦЦ и 7ХТ-АА. Међу њима, молекул 2ХТ-АА, заснован на циклизацији од главе-на-од главе до-остатка аланина на оба краја пептида НО.2, показао је најбољу активност (структура приказана на доњој слици), са конкурентном ЕЛИСА ИЦ50 од 8.18н теста (активност 8.1М тестера). метод: ИЛ-23 стимулише ДБ ћелијску линију трансфектовану СТАТ3 репортерским геном, а инхибиторна активност је квантификована детекцијом експресије репортер гена). Ово је представљало повећање активности од 4-6 пута у поређењу са линеарним пептидом. У ин витро тестовима активности, 2ХТ-АА је ефикасно инхибирао ИЛ-23-индуковану секрецију ИЛ-17Ф у хуманим Тх17 ћелијама на начин зависан од концентрације и блокирао производњу ИЛ-22 у хуманим ПБМЦс и спленоцитима пацова. Истовремено, овај циклични пептид је такође смањио нивое ИЛ-17Ф мРНА у спленоцитима пацова. Нажалост, упркос обећавајућој фармаколошкој активности 2ХТ-АА, нису пронађени накнадни извештаји о оптимизацији ове цикличне пептидне структуре и њених деривата помоћу МДЛ-а.